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基 因 型Agrobacterium rhizogenes (strR ) pRi2659 (agropine type)簡 要 說 明發(fā)根農桿菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)農桿菌屬(agrobacterium)的一種革蘭氏陰性土壤細菌，它能夠感染大多數雙子葉植物和少數單子葉植物以及個別裸子植物。K599發(fā)根農桿菌（NCPPB2659）含有pRi2659農桿堿型Ri質粒，具有廣泛的宿主范圍（葫蘆科，豆科，茄科等），同時具有鏈霉素抗性。生物生產的K599化學轉化感受態(tài)細胞經特殊工藝制作，pCAMBIA2301質粒（卡那霉素抗性）檢測，轉化效率>103 cfu/μg DNA 操 作 說 明1.取-80℃保存的K599發(fā)根農桿菌感受態(tài)于室溫或手心片刻待其部分融化，處于冰水混合狀態(tài)時插入冰中。2.  每100μl感受態(tài)加入0.01-1 μg質粒DNA（轉化效率較高，第一次使用前最好做預實驗確定所加質粒的量），用手快速、劇烈撥打管底混勻或用槍吹吸混勻，依次放于冰中靜置5分鐘、液氮5分鐘、37℃水浴5分鐘、冰浴5分鐘。3. 冰浴中拿出放室溫，加入700μl 無抗生素的TY液體培養(yǎng)基，于28℃振蕩培養(yǎng)2小時。4. 6000 rpm 離心一分鐘收菌，留取 100 μl 左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的 TY平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3 天注 意 事 項1. 加入質粒時體積不應大于感受態(tài)體積的1/10；質粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉化效率急劇下降；質粒增大一倍，轉化效率下降一個數量級。2. 混勻質粒時應用手指快速撥打管底或用槍吹吸混勻，務必使質?？焖佟⒕鶆蚍稚㈤_，與感受態(tài)細胞充分接觸。轉化高濃度的質?？上鄳獪p少最終用于涂板的菌量。3. 平板上陽性克隆密度過大時，由于營養(yǎng)不足，陽性克隆生長變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應減少質粒用量或降低涂板的菌量。4.  K599具有鏈霉素抗性，不可用于具有鏈霉素抗性質粒的轉化。

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